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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人宮頸癌組織源成纖維分離自患有宮頸癌病人的宮頸癌組織；宮頸癌也稱子宮頸癌，指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性腫瘤的位。宮頸癌可向鄰近組織和器官直接蔓延，向下至陰道穹窿及陰道壁，向上可侵犯子宮體，向兩側(cè)可侵犯盆腔組織，向前可侵犯膀胱，向后可侵犯直腸。也可通過淋巴管轉(zhuǎn)移至宮頸旁、髂內(nèi)、髂外、腹股溝淋巴結(jié)，晚期甚至可轉(zhuǎn)移到鎖骨上及全身其他淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移比較少見，常見的轉(zhuǎn)移部位是肺、肝及骨。腫瘤微環(huán)境即腫瘤細(xì)胞生存的外部環(huán)境，由不同種類的非腫瘤性的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）構(gòu)成，包括纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，腫瘤細(xì)胞通過調(diào)控這些間質(zhì)細(xì)胞，創(chuàng)造出有利于自身侵襲轉(zhuǎn)移的條件，從而使得腫瘤得到進(jìn)展。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境的改變?cè)谀[瘤進(jìn)展中扮演著重要的角色。在腫瘤微環(huán)境中，研究多也是主要的間質(zhì)細(xì)胞是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）。CAFs 主要由腫瘤周邊的正常成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞演化而來。宮頸癌組織源成纖維細(xì)胞多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。剛分離的宮頸癌組織源成纖維細(xì)胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細(xì)胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長(zhǎng)，不聚集成團(tuán)；細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng)，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細(xì)胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。

方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人宮頸癌成纖維采用混合膠原酶消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人宮頸癌成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

兔血管生成素2(ANG-2)ELISA 試劑盒

Oxidized low density lipoprotein aibody against rat (OLAb) ELISA Kit 大鼠氧化低密度脂蛋白抗體(OLAb)檢測(cè)試劑盒

HumanLeishimariaaibodyELISAKit 人利什曼原蟲抗體(LeishimariaAb)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

HumanFreeTestoterone,F-TESTO檢測(cè)試劑盒人游離睪同(F-TESTO)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織半胱蛋白酶-3(CASPASE-3)活性熒光定量檢測(cè)試劑盒20次

HumanNeural-Cadherin,N-CadELISAKit人N鈣黏蛋白/神經(jīng)鈣黏蛋白(N-Cad)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

CXADR重組小鼠 CXADR / CAR 蛋白 Protein

骨成型蛋白2(BMP2)重組蛋白 Recombinant Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)

PDHA1重組人 PDHA1 / C54G1 蛋白 (aa 30-390, His & GST 標(biāo)簽) Protein

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TGFB2 Protein Canine 重組狗 TGFB2 / TGF-beta 2 蛋白

白介素16(IL16)重組蛋白 Recombinant Interleukin 16 (IL16)

CEACAM3 Protein Human 重組人 CEACAM3 / CD66d 蛋白

IL5重組小鼠 IL5 蛋白 Protein

TSPAN7 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 TALLA-1 / TSPAN7 蛋白

PFDN4重組人 PFDN4 / PFD4 蛋白 Protein

小鼠A(VA)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat osteonectin (ON) ELISA Kit 大鼠骨粘連蛋白(ON)檢測(cè)試劑盒

HumanCCAAT/enhancerbindingproteinalpha,C/EBPαELISAKit 人CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

ChickenLeinizingHormone,LH檢測(cè)試劑盒雞促黃體激素(LH)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

載玻片細(xì)胞NFKAPPABP50蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒10/20次

MouseFreei-iodothyronineIndes,Free-T3ELISAKit小鼠游離三甲狀腺原(Free-T3)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

人宮頸癌成纖維細(xì)胞小鼠胃動(dòng)素(MTL)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠(Pepsin)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠胃腸癌標(biāo)志物CA199檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠K1(VK1)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝